貨號(hào)：10456-1， 包裝：10ML(50次），價(jià)格：360元
貨號(hào)：10456-2， 包裝：50ML(250次），價(jià)格：1400元
英文名稱：Exosome Isolation Kit from Cell Culture Media by Precipitation Method
細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒(沉淀法)
產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
Proandy生產(chǎn)的細(xì)胞上清外泌體提取試劑盒(沉淀法) (Exosome Isolation Kit from Cell Culture Media by Precipitation Method)，也稱為細(xì)胞培養(yǎng)液上清外泌體提取試劑盒、外泌體純化試劑盒、外泌體抽提試劑盒、Total Exosome Isolation Kit， 是一種高效、便捷的用于細(xì)胞培養(yǎng)液上清中外泌體或其它細(xì)胞外囊泡提取的試劑盒，僅需簡(jiǎn)單的較低速度離心即可從樣品中分離 出大量完整的、純度較高的外泌體。使用本試劑盒提取的外泌體可用于蛋白分析、核酸分析、Western blot、PCR、RNA提取、高通量測(cè)序、外泌體粒徑和濃度分析即納米顆粒示蹤分析(Nanoparticle tracking analysis, NTA)、電鏡分析、細(xì)胞共培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)。
外泌體(Exosome)是膜包裹的細(xì)胞外囊泡(Extracellular vesicles, EVs)，直徑約為40-160nm，具有脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)，天然存 在于血液、尿液、腦脊液，以及體外培養(yǎng)細(xì)胞的上清液中，幾乎所有類型的細(xì)胞都可以產(chǎn)生并釋放外泌體。細(xì)胞膜內(nèi)吞(Endocytosis)依次形成初級(jí)內(nèi)體(Early sorting endosome, ESE)、次級(jí)內(nèi)體(Late sorting endosome, LSE)和多囊泡體(Multivesicular body, MVB)，其中多囊泡體包含腔內(nèi)囊泡(Intraluminal vesicles, ILVs)。多囊泡體與細(xì)胞膜融合形成外泌體,外泌體攜帶多種來(lái)自其母體細(xì)胞的成分(包括核酸、蛋白質(zhì)、脂類、糖類和代謝物等)釋放到胞外基質(zhì)中。外泌體可以被附近或遠(yuǎn)距離的細(xì)胞識(shí)別和融合，是細(xì)胞間進(jìn)行相互調(diào)控的重要媒介，參與了癌癥、神經(jīng)退行性病變和炎癥性疾病等多種疾病的發(fā)病過(guò)程，影響細(xì)胞多方面的功能。
本產(chǎn)品采用多聚物沉淀法，設(shè)備要求低、操作方便、提取時(shí)間短、樣品起始量低、提取效率高、外泌體形態(tài)比較完整.
本產(chǎn)品無(wú)RNA酶、無(wú)DNA酶、無(wú)蛋白酶。使用本產(chǎn)品提取得到的外泌體可以用于RNA、DNA及蛋白的各種應(yīng)用.
按使用說(shuō)明操作，每次提取1ml樣品需190μl的細(xì)胞上清外泌體提取試劑，本品10ML試劑盒可使用約50次，本品50ML試劑盒可使用約250次。
使用說(shuō)明：
1. 樣品的準(zhǔn)備。
A.在適當(dāng)?shù)臈l件下培養(yǎng)所需細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70%-80%時(shí)(處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，加入不含外泌體的血清培養(yǎng)液或適當(dāng)?shù)牡臒o(wú)血清培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)12-24小時(shí)，待細(xì)胞密度達(dá)90%-100%時(shí)，收集細(xì)胞上清。 注1：由于血清中含有非常多的外泌體，為了避免污染，此時(shí)需要加入不含外泌體的血清。不含外泌體的血清可以通過(guò)超速離 心法獲得，也可以直接使用無(wú)外泌體的血清。也可以根據(jù)具體的實(shí)驗(yàn)條件，使用不含血清的培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，某些細(xì)胞可無(wú)血清正常生長(zhǎng)約12個(gè)小時(shí)，或者增加不含細(xì)胞的培養(yǎng)液組作為陰性對(duì)照。 注2：細(xì)胞上清中外泌體的量隨細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)和細(xì)胞數(shù)量的差別而有一定的差異，須根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求決定樣品的起始量。 注3：細(xì)胞凋亡、死亡過(guò)程中會(huì)釋放大量囊泡，這些囊泡在外泌體的提取純化過(guò)程中會(huì)污染活細(xì)胞產(chǎn)生的外泌體，請(qǐng)確保細(xì)胞狀態(tài)良好，凋亡或死亡細(xì)胞占比盡量不超過(guò)5%。
B.將收集的細(xì)胞培養(yǎng)液在4oC，500×g離心5分鐘，輕輕緩慢地吸取上清液至一新的離心管中；再將上清液在4oC，10,000-16,500 ×g離心30分鐘，輕輕緩慢地吸取上清液至一新的離心管中。
C.用0.22μm的針頭濾器(FF342/FF362/FF372)過(guò)濾上清液，進(jìn)一步去掉較大的細(xì)胞囊泡和凋亡小體等雜質(zhì)，將過(guò)濾后的上清液 轉(zhuǎn)移至新的離心管中。
D.選做：使用10-100kDa之間的超濾管(如FUF158)對(duì)上清液進(jìn)行濃縮。將濃縮后的上清液從超濾管的死體積收集器中取出，用 于后續(xù)外泌體提取。 注：一些細(xì)胞(干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞)分泌的外泌體較少，可以將細(xì)胞上清液體積濃縮10倍左右再進(jìn)行后續(xù)的外泌體提?。欢鴮?duì)于 外泌體分泌量多的腫瘤細(xì)胞等，可以不進(jìn)行濃縮或?qū)⒓?xì)胞上清液體積濃縮2-5倍左右在進(jìn)行后續(xù)的外泌體提取。具體濃縮倍數(shù) 可根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整。
2. 外泌體提取。
A. 每1ml步驟1中準(zhǔn)備好的上清液樣品中加入190μl細(xì)胞上清外泌體提取試劑，吹打混勻后置于4oC，靜置4小時(shí)或者過(guò)夜。 注：外泌體提取試劑非常粘稠，需緩慢吸取，緩慢加入，并確保外泌體提取試劑與細(xì)胞上清液充分混勻。如果細(xì)胞分泌的外泌 體較少，則可以通過(guò)增加靜置的時(shí)間以提高外泌體得率。
B. 10,000×g在4oC離心30分鐘，用1ml吸頭小心吸除上清液，盡可能吸凈上清液但不要觸碰沉淀，收集沉淀，即為外泌體。 注：細(xì)胞培養(yǎng)液樣品中外泌體一般含量較少，此時(shí)可能肉眼觀察不到沉淀，如果離心時(shí)使用角轉(zhuǎn)子，注意標(biāo)記離心管擺放方向， 并在底部位置畫(huà)圈標(biāo)識(shí)。
C. 離心獲得的外泌體沉淀可用適量的PBS或者生理鹽水重懸，一般10ml細(xì)胞培養(yǎng)液的起始量使用0.1-1ml重懸液進(jìn)行重懸；也可直接將沉淀用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 注：外泌體可在4oC保存1周，或在-20℃及更低溫度長(zhǎng)期保存。
D. 選做：某些樣品中的非外泌體雜質(zhì)較多，導(dǎo)致沉淀比較多，此時(shí)可通過(guò)重懸并短暫離心去除雜質(zhì)。將沉淀用適量的PBS重懸， 然后12,000×g在4oC離心2分鐘，取上清。若沉淀較多，可將上清多次12,000×g在4oC離心2分鐘，直至無(wú)明顯沉淀。 注1：沉淀可能較難重懸，需反復(fù)多次吹打。 注2：需根據(jù)后續(xù)的純化方法選擇合適的重懸液。
3. 外泌體純化(可選)。
A.獲得的外泌體可通過(guò)外泌體純化柱或親和層析法等方法進(jìn)一步進(jìn)行純化。
B.若需要獲得無(wú)菌的外泌體，則可使用0.22μm的針頭濾器進(jìn)行過(guò)濾。為減少損失，請(qǐng)先將濾器用PBS進(jìn)行潤(rùn)洗。若提取的外泌 體暫時(shí)不使用，可進(jìn)行分裝后于-80oC保存.
注意事項(xiàng)：
1---本產(chǎn)品較為粘稠，使用時(shí)需完全混合均勻后再吸取，并保證吸取體積準(zhǔn)確。
2---本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
3---為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
保存條件：
4oC保存，一年有效。室溫保存，一個(gè)月有效。-20oC保存，至少兩年有效。